建立PCP實(shí)驗室必須要知道以下八大項。為了對以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復檢測,需要三個(gè)不同的區域,每一個(gè)區域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出。 1、樣品準備區 這個(gè)區域專(zhuān)門(mén)用

　　建立PCP實(shí)驗室必須要知道以下八大項。為了對以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復檢測,需要三個(gè)不同的區域,每一個(gè)區域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出。

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　　1、樣品準備區

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　　這個(gè)區域專(zhuān)門(mén)用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應該采取預防措施：

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　　1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。

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　　2）組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。

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　　3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

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　　4）DNA樣品應該用有專(zhuān)門(mén)的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

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　　5）大體積樣品應該用單獨包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。

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　　6）管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì )產(chǎn)生氣溶膠。

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　　7）任何時(shí)候都應該穿實(shí)驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。

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　　2、樣品準備和RNA-PCR

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　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會(huì )。為了避免這一問(wèn)題，反轉錄一步可以在樣品準備區進(jìn)行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

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　　3、前PCR區

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　　必須有專(zhuān)門(mén)用于準備各種反應的區域，這個(gè)區域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

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　　4、PCR實(shí)驗室試劑的操作

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　　1）所用的所有溶液都應該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。

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　　2）所有PCR試劑中使用的水都應該是高質(zhì)量的——新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。

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　　3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。

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　　4）所用試劑都應該以大體積配制，實(shí)驗一下看試劑是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

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　　5）所有試劑和樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

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　　6）新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。

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　　7）樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時(shí)都應該小心保存。

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　　5、在前PCR區建立PCR混合物

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　　1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

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　　2）如果你的實(shí)驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

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　　3）作為一個(gè)規則，應該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強陽(yáng)性對照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。

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　　4）陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。

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　　5）當做陽(yáng)性對照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應該使用最少數量的核酸。

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　　6）由于必須有對照反應，對照模板的特點(diǎn)應該予以考慮。

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　　6、控制污染的方法

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　　已設計出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染?使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線(xiàn)，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數量級。

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　　7、PCR儀的位置

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　　8、后PCR區

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　　以上，PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。