發(fā)布時(shí)間:2023-03-19 21:30:31 人氣:4746
建立PCP實(shí)驗(yàn)室必須要知道以下八大項(xiàng)。為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測(cè),需要三個(gè)不同的區(qū)域,每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出。 1、樣品準(zhǔn)備區(qū) 這個(gè)區(qū)域?qū)iT(mén)用
建立PCP實(shí)驗(yàn)室必須要知道以下八大項(xiàng)。為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測(cè),需要三個(gè)不同的區(qū)域,每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出。
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1、樣品準(zhǔn)備區(qū)
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這個(gè)區(qū)域?qū)iT(mén)用作樣品的準(zhǔn)備,在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施:
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1)PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。
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2)組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理,以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。
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3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
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4)DNA樣品應(yīng)該用有專(zhuān)門(mén)的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。
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5)大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。
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6)管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,而且管子不能用力崩開(kāi),這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。
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7)任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套,手套要經(jīng)常更換,尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準(zhǔn)備間,經(jīng)常清洗。
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2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
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RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題,反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。
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3、前PCR區(qū)
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必須有專(zhuān)門(mén)用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域,這個(gè)區(qū)域必須保持干凈,而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備,特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
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4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
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1)所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
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2)所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的——新鮮蒸餾的去離子水,用0.22μm過(guò)濾的,并且是高壓滅菌。
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3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑,在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
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4)所用試劑都應(yīng)該以大體積配制,實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。
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5)所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
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6)新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。
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7)樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。
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5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
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1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃,在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。
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2)如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物,以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì),可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
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3)作為一個(gè)規(guī)則,應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且,你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
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4)陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染,陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
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5)當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí),有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
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6)由于必須有對(duì)照反應(yīng),對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
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6、控制污染的方法
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已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染?使用UNG,這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線,這種方法不能完全消除污染問(wèn)題,但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
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7、PCR儀的位置
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8、后PCR區(qū)
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以上,PCR完成以后,需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù),應(yīng)該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的,決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。